大麻二酚（cannabidiol，CBD）可用于治療多種病癥及緩解疼痛。最近，FDA批準了一種高純度CBD制劑（Epidiolex）用于治療癲癇。從大麻植物中提取的CBD粗提物含有大量其它物質，包括精神活性物質四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC），由于THC在大多數國家是受管控的，因此純化CBD時必須要求將THC降低至100-1000 ppm。傳統(tǒng)的CBD純化方法，即單柱層析，是以犧牲CBD收率為代價將THC含量降低至該水平的，浪費了大量目標產物。通過Multi-column Counter-current Solvent Gradient Purification（MCSGP，多柱逆流溶劑梯度純化）可有效解決該問題，能夠分離出高純度、高收率、高產量的目標產物，且純化效率顯著優(yōu)于單柱層析。本文闡述如何從預處理的大麻植物提取物中獲得高純度CBD，并將THC含量降低至要求范圍內。
介 紹
在大麻二酚（CBD）的生產中，THC及其它植物性雜質（如蠟質和色素）很難去除，需要經過一系列的預處理和純化步驟，才能從大麻中提取獲得高純度、低THC含量的CBD產品。
從大麻提取物中純化CBD需要進行預處理，包括植物的粉碎、干燥、CO2提取、脫羧和蒸餾、層析和結晶。為了將大麻相關雜質（主要是THC）降低至100 ppm，必須采用層析方法。提取物中的蠟質和其它雜質會對層析填料造成污染，所以必須在層析之前通過預處理將這些雜質去除干凈。大麻素類物質的水溶性較差，需要采用反相層析進行純化，相關工藝的有機溶劑用量很大。一些雜質與CBD產品出峰有重疊部分，分離具有挑戰(zhàn)性。采用單柱層析，需要在純度和收率之間做出權衡，兩者此消彼長，若要獲得高純度的CBD，通常收率都很低。如何在獲得高純度的產品的同時，保證高收率，是該工藝所面臨的難點。
MCSGP原理
Multi-column Counter-current Solvent Gradient Purification（MCSGP）是采用雙柱進行連續(xù)純化，可以解決單柱層析時純度和收率無法同時保證的問題。
采用MCSGP，可將含有不純組分的產品回收再純化， 進行循環(huán)式的層析操作，從而最大限度地提純產品， 使得純度和收率二者兼得。
圖1. 傳統(tǒng)單柱層析（左）：重疊組分被舍棄；MCSGP（右）：重疊組分被在線回收，再次純化。
材料和方法
工藝步驟：大麻是在室內受控環(huán)境下生長的，需對大麻進行采摘、干燥、預處理和純化。
圖2. CBD工藝步驟
層析樣品：
層析的上樣樣品是蒸餾液和甲醇的混合物，CBD純度為85.2%，濃度為250 g/L。該結果通過Agilent 1100型高效液相，采用C8反相柱測得，測定波長為230 nm，標準進樣量為10 μL。經測定，上樣樣品中的THC含量為4.8%（48,000 ppm）。
圖3. 上樣樣品分析圖譜
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層析純化：
同時采用單柱層析和雙柱MCSGP純化CBD，測定280 nm處紫外吸收值。層析柱內徑10 mm，柱床高度150 mm，柱床體積11.9 mL，裝填介質為C18反相填料。每次上樣體積為0.37 mL。以70% B進行等度洗脫，洗脫流速305 cm/h（即4 mL/min），洗脫時長90 min。洗脫完畢后進行層析柱清洗。所有操作均在室溫（25℃±3℃）進行。該條件下，層析柱的反壓為50 bar。
單柱層析結果
層析過程圖譜見圖4和圖5。分段收集洗脫產物，并進行液相分析（圖5）。
圖4. C18純化CBD過程圖譜，顯示UV280 nm、CBD濃度、THC含量（THC含量在10min左右開始顯著升高）
圖5. 層析過程圖譜局部放大，顯示目標物（CBD）和主要雜質濃度
MCSGP設計
MCSGP采用與單柱工藝相同的層析柱、溶劑及基本工藝參數。
圖6. MCSGP工藝設計流程圖
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STEP 1：根據分段收集及液相分析結果，對單柱層析圖譜進行區(qū)域劃分設計（圖7）。
圖7. 單柱層析圖譜進行區(qū)域劃分設計
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A：CBD濃度2.7 g/L（2,000 mAU）時開始進行回收（recycle）；
B：CBD濃度13.3 g/L（10,000 mAU）時開始收集目標產物（product）；
? ? ? ?C：紫外值降低至最大峰值90%時結束收集目標產物，并再次開始回收；
D：6 min后，結束回收。
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STEP 2：設定層析柱規(guī)格及上樣量。MCSGP所用2根層析柱的規(guī)格與單柱層析完全相同。
STEP 3：設定基本工藝參數。MCSGP基本工藝參數與單柱層析完全相同。
STEP 4：設定cycle次數，MCSGP向導軟件自動顯示上樣總量，自動生成StartUP及ShutDown方法。如因環(huán)境條件（溫度等）造成出峰漂移等，可選擇開啟MControl過程控制功能，保證工藝穩(wěn)定性。
MCSGP向導軟件可自動計算回收階段的在線稀參數，并可顯示所需進料的總體積、溶劑和運行時間等。
MCSGP操作
為了優(yōu)化MCSGP工藝，在不同的操作條件下進行了多次運行，對產品洗脫區(qū)和回收區(qū)的劃分進行了細微調整，最終確定出最佳條件，并以該條件運行MCSGP。圖8顯示了最終用于CBD純化的MCSGP運行圖譜，總計運行了8個cycle，由圖可見cycle重現性良好。
圖8. MCSGP運行圖譜，總計運行8個cycle。該圖僅顯示柱1的UV變化，藍色
和綠色區(qū)域為回收區(qū)，位于藍色和綠色之間的紅色區(qū)域為目標產物收集區(qū)。
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圖9. MCSGP各cycle的疊加圖譜
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圖9各cycle重疊性良好，表明MCSGP功能運行穩(wěn)定，各cycle的產率、產品濃度及純度均保持穩(wěn)定。保留時間和峰形的變化由MControl自動補償，MControl根據紫外線閾值啟動CBD收集，當紫外值降低至最大峰值90%時結束收集。
使用分析液相測定MCSGP每個cycle洗脫產物（2個/cycle，每柱各1個）的純度和產物濃度。圖10顯示，CBD產品的純度大于99.5%。
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圖10. MCSGP純化所得CBD液相分析圖譜
單柱層析與MCSGP的對比
從收率、純度、產率、產品濃度和溶劑消耗等方面對單柱層析和雙柱MCSGP進行了計算和比較，MCSGP在各方面均表現出明顯優(yōu)勢。
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圖11. 純度 - 收率曲線
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圖11為單柱層析與MCSGP收率對比圖。已規(guī)定最大THC含量為100 ppm，在這一水平，單柱層析的CBD收率僅為52%，而MCSGP的CBD收率為94%，比單柱層析高出80%。
圖12. 純度 - 產率曲線
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MCSGP可用于不同工藝要求。如果對目標產品的純度要求并不高，采用MCSGP可使產率進一步提高。比如某企業(yè)要求THC含量上限為1000 ppm時，收率水平不得低于85%，用MCSGP代替單柱層析后，產率由原來的8 g/L/h提高到了60 g/L/h以上。而另一工藝情況為，當從單柱層析轉換為MCSGP時，保持產率不變，雜質THC含量可從1000 ppm降低至100 ppm。見圖12純度 - 產率曲線。
圖13. 純度 - 溶劑消耗曲線
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圖13顯示了單柱層析和MCSGP的溶劑消耗對比。在要求THC最大含量為1000 ppm時，MCSGP可使溶劑消耗量降低30%。單柱層析的溶劑消耗量為每mL上樣樣品消耗95 mL溶劑，而MCSGP的溶劑消耗量僅為每mL上樣樣品消耗65 mL溶劑。
總結
與單柱層析相比，MCSGP在大麻二酚（CBD）的純化和雜質THC的去除方面具有明顯優(yōu)勢。主要包括：
1. 在THC含量要求100 ppm時，MCSGP可使CBD收率提高80%左右；
2. 在THC含量要求1000 ppm時，MCSGP可使產率提高7.5倍左右；
3. 在THC含量要求1000 ppm時，MCSGP可使溶劑消耗量降低30%。
溶劑消耗量的減少可顯著降低溶劑采購成本、溶劑再生/處理成本，并減少制備和儲存溶劑所需的占地面積。
MCSGP的每個cycle僅收集2次（per cycle / per switch），而單柱層析過程的各組分需要分段收集、送檢，因此采用MCSGP，可使HPLC檢驗工作量顯著降低。
通過MCSGP提高產率，可應用于多種生產方式：
1. 可采用更小規(guī)格的層析柱，在相同的時間內，完成與單柱層析相同的生產任務；
2. 可采用與單柱層析相同規(guī)格的層析柱，在更短的時間內完成生產任務；
3. 層析介質體積相同時，可在相同時間內獲得更多的產品。
層析系統(tǒng)介紹
Contichrom HPLC：Contichrom HPLC是一套多用途的制備型實驗室級層析系統(tǒng)，可運行多種單柱和雙柱模式。ChromIQ是Contichrom系統(tǒng)的操作軟件，其中包括MCSGP向導功能。
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EcoPrime Twin HPLC ：EcoPrime Twin HPLC為生產型連續(xù)流層析系統(tǒng)，可在GMP條件下運行MCSGP功能，滿足MCSGP工藝的有效線性放大。
北京慧德易專注于層析領域十余年，現與瑞士ChromaCon公司強強聯合，將世界領先的Contichrom雙柱連續(xù)流層析技術引進中國，并已于2017年在北京昌平生命科學園蛋白質藥物國家工程研究中心成立慧德易實驗室&培訓中心，現已成功舉辦多期連續(xù)流技術培訓班。
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