寡核苷酸是合成的短鏈DNA或RNA分子，可用于治療，通過與目標(biāo)基因或蛋白序列結(jié)合來阻礙基因表達(dá)或蛋白發(fā)揮作用。快速增長(zhǎng)的寡核苷酸療法市場(chǎng)包括靶向性非常強(qiáng)的反義DNA和小干擾RNA (siRNA)，在治療癌癥、遺傳病和其他疾病方面有著廣泛的應(yīng)用前景。
液相色譜技術(shù)具有分離效率高、選擇性好、檢測(cè)靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，已成為核酸藥物生產(chǎn)與質(zhì)控分析必不可少的重要手段。本期內(nèi)容將介紹TSKgel色譜柱在寡核苷酸分析中的應(yīng)用。
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治療性寡核苷酸分離色譜模式如下圖：
一、離子交換色譜柱
TSKgel DNA-NPR陰離子交換色譜柱性能參數(shù)。
基質(zhì) | 聚甲基丙烯酸酯 |
粒徑 | 2.5μm |
孔徑 | 無孔 |
官能團(tuán) | 獨(dú)有 |
抗衡離子 | ClO4- |
pH耐受范圍 | 2.0-12.0 |
蛋白容量 | 5g BSA/L |
離子交換容量 | 0.1eq/L |
pKa | 11.2 |
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下圖是TSKgel DNA-NPR陰離子交換色譜柱對(duì)13個(gè)堿基的硫代磷酸寡核苷酸粗樣分析的色譜圖。
色譜條件：
色譜柱：TSKgel DNA-NPR（4.6×75mm）
流動(dòng)相：A：20mmol/L NaOH（pH 12）+10mmol/L NaBr+1%二乙胺
????B：20mmol/L NaOH（pH 12）+1mol/L NaBr+1%二乙胺
梯度：3.5min（20%B），12min（20%B），45min（55%B）
流速：1.0ml/min
檢測(cè)：UV260nm
溫度：60℃
樣品：粗合成寡核苷酸（13mer，脫保護(hù)）
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一、尺寸排阻色譜柱
硅膠基質(zhì)填料表面鍵合二醇基，粒徑2μm，適用于小分子蛋白、多肽、寡核苷酸等生物分子的快速、高分辨率分析。可兼容UHPLC系統(tǒng)與常規(guī)HPLC系統(tǒng)。
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基質(zhì) | 硅膠 |
官能團(tuán) | 二醇基 |
粒徑 | 2μm |
孔徑 | 12.5nm |
分子量排阻限 | 500 kDa |
分離范圍 | 5-100 kDa |
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在寡核苷酸的分析中，尺寸排阻分離模式是基于堿基數(shù)量、磷酸基不同導(dǎo)致的分子量差別進(jìn)行分離，通常用于簡(jiǎn)單的質(zhì)量控制或純度研究。?
下圖是采用兩根串聯(lián)的SEC色譜柱TSKgel UP-SW2000來區(qū)分長(zhǎng)度相差一個(gè)堿基的寡核苷酸混合物 (20-mer和N-1 19-mer)。
色譜條件：
色譜柱：TSKgel UP-SW2000（2μm，4.6×300mm×2）
流動(dòng)相：50mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）
?????300mmol/L NaCl，0.03%?NaN3
流速：0.2 ml/min
檢測(cè)：UV260nm
樣品：19-mer and 20-mer
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