什么是離子交換色譜

利用分析樣品和填料中導(dǎo)入的離子交換基團之間的靜電相互作用的差異的分離模式。根據(jù)離子交換官能團的電荷不同，可分為陰離子交換色譜和陽離子交換色譜。陰離子交換色譜用填料中，導(dǎo)入了陽離子性的叔氨基或季銨基等；陽離子交換色譜用填料中，導(dǎo)入了陰離子性的磺酸基或羧基等。蛋白的靜電性質(zhì)隨pH值的變化而發(fā)生變化。正負(fù)電荷正好平衡時，整體不帶電荷的固有pH值稱為等電點（表示為PI）。在更低pH值時，整體帶正電荷；更高pH值時，整體帶負(fù)電荷。見下圖。

pH 變化引起蛋白電荷狀態(tài)變化的示意圖

?

因此在陰離子交換色譜中，用pH值略高于（+0.5至+1.0）等電點的流動相；在陽離子交換色譜中，用pH值略低于（-0.5至-1.0）等電點的流動相作為分離條件優(yōu)化的初始起點。

與填料靜電結(jié)合的分析樣品一般使用鹽濃度梯度洗脫法進行洗脫。增加流動相的離子強度（鹽濃度）時，靜電相互作用會逐漸減弱。當(dāng)與離子交換基的靜電結(jié)合斷開時，分析樣品會在色譜柱內(nèi)移動，如下圖。由于分析樣品不同，脫離填料時的鹽濃度也就不同。因此，樣品中等電點不同的組分就在不同時間被洗脫而分離開。由于蛋白的靜電性質(zhì)隨pH值的變化而變化，因此，也可以通過改變pH值進行分離（稱為pH梯度洗脫法）。

蛋白離子交換反應(yīng)的示意圖（陽離子交換）

?

離子交換色譜具有分辨率高、吸附量大（載量高）等特點。并且，通過調(diào)整梯度洗脫的梯度，可以輕松調(diào)控或優(yōu)化分離。

氨基酸和電荷

由于構(gòu)成蛋白的氨基酸具有酸性、堿性貨不帶電荷的側(cè)鏈，因此，蛋白本身的靜電特性也會隨著這些氨基酸組合的不同而變化。另外，由于末端存在未結(jié)合肽的羧基（C末端）和氨基（N末端），因此蛋白將始終顯示離子性質(zhì)。

離子交換基團的種類

一般離子交換色譜用填料中，導(dǎo)入的離子交換基團的種類如下表所示。

離子交換基團的種類和構(gòu)造

?

交換基團不同，吸附特性、分離選擇性也不同。因此，選擇適合要進行測定的分析樣品的填料非常重要。因離子交換基團不同而造成的選擇性差異如下圖所示。下圖a中，三種蛋白在磺酸基型填料上獲得良好的分離；于此相對，使用羧基型填料時，細胞色素C和溶菌酶的洗脫峰接近，未能充分分離。另一方面，在下圖b中，三種蛋白在羧基型填料上均獲得了良好的分離；于此相對，使用羧基型填料時，胰蛋白酶原和核糖核酸酶A洗脫峰接近，未能充分分離。

不同離子交換基團的選擇性差異

?

離子交換基團導(dǎo)入方法的差異

? ? 傳統(tǒng)的離子交換色譜用填料，一般在基質(zhì)表面單純地導(dǎo)入離子交換基團。最近，出現(xiàn)了為增加吸附載量，導(dǎo)入緩慢交換的離子交換基團的方法（網(wǎng)狀化）以及在側(cè)鏈中引入具有離子交換基團的單鏈聚合物的方法（接枝聚合）等，如下圖。通過網(wǎng)狀化或接枝聚合化，可立體地導(dǎo)入離子交換基團，因為獲得更高的吸附載量。另外，通過立體導(dǎo)入，有時還可獲得不同的選擇性。

官能團導(dǎo)入方法及其性質(zhì)